UV280吸收值

发表于 2024-8-27 14:39:54

请问一下UV280nm什么物质会有吸收峰，我用GS115发酵了一批蛋白（培养基为BMGY、BMMY），蛋白在上清中用膜包浓缩、置换buffer（0.05M 磷酸盐缓冲液 pH6.5）后过阴阳离子柱，A液为0.05M 磷酸盐缓冲液 pH6.5，B液为0.05M 磷酸盐缓冲液 pH6.5+1M NaCl，梯度洗脱后蛋白在0.2M NaCl洗脱下来，但是后面0.7M 和1M NaCl（100-120mL）洗脱时UV280峰值特别高，但不是蛋白，求问是什么物质在UV280处会有这么高的吸收峰？

洗脱.PNG

发表于 2024-8-27 14:39:55

在 UV280nm 处有吸收峰的物质可能有以下几种：
芳香族氨基酸：蛋白质中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基含有共轭双键，在 280nm 附近有最大的光吸收峰，这是蛋白质在该波长处有特征吸收的主要原因。如果你的蛋白样品中这几种氨基酸含量较高，或者存在含有这些氨基酸的短肽，可能会在 280nm 处有较强吸收。
核酸：核酸对紫外光也有吸收，在 280nm 处的吸收比蛋白质强（每克），虽然其吸收高峰在 260nm 附近，但也可能在 280nm 处有一定的贡献，尤其是当样品中核酸含量较高时。
其他含有共轭双键的分子：除了芳香族氨基酸，其他含有共轭双键结构的分子，如某些辅酶、维生素等，也可能在 280nm 处有吸收峰，但在你的实验体系中，这些物质存在的可能性相对较小。
由于你在蛋白纯化过程中进行了多种操作，且在 0.7M 和 1M NaCl（100 - 120mL）洗脱时出现了高吸收峰，可能的原因有：
蛋白与其他物质的复合物：蛋白可能与一些在该波长有吸收的物质形成了复合物，导致吸收峰增强。这些物质可能是在纯化过程中引入的，或者是原本就与蛋白结合的。
部分变性的蛋白或聚集的蛋白：如果蛋白在纯化过程中发生了部分变性或聚集，其结构可能发生变化，使得原本隐藏的芳香族氨基酸残基暴露出来，从而导致在 280nm 处的吸收增加。
杂质：尽管经过了一系列纯化步骤，但仍有可能存在一些未被完全去除的杂质，这些杂质可能在 280nm 处有吸收。
为了确定具体是什么物质导致了高吸收峰，可以考虑以下方法：
进行光谱分析：使用更高级的光谱仪器，如紫外 - 可见 - 近红外光谱仪，对出现高吸收峰的样品进行更详细的光谱扫描，观察吸收峰的形状、宽度和强度等特征，与已知物质的光谱进行对比，以推测可能的物质。
分离和鉴定：通过进一步的分离技术，如高效液相色谱（HPLC）或凝胶过滤色谱等，将出现高吸收峰的部分与其他成分分离，然后对分离出的物质进行鉴定，例如通过质谱分析等方法确定其组成和结构。
对比实验：设置对照组实验，例如使用未经过相同处理的蛋白样品，或者在相同条件下处理已知成分的样品，观察是否也会在 280nm 处出现类似的高吸收峰，以帮助排除一些可能性。

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