本帖最后由 134139 于 2025-3-20 13:38 编辑
求助：我在进行针对细菌全菌为靶标的核酸适配体selex筛选时，文库与靶标结合后分离出来的单链无法正常进行培训人扩增。尿素变性胶对单链dna进行电泳结果出现凝胶阻滞且条带大小不对。具体操作步骤如下： 使用一个88bp的文库，用500 μLtbe基础缓冲液溶解(10 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，2.7 mM KCl，0.2 mM EDTA-2Na） 取400 μL初始ssDNA文库95 ℃水浴变性5 min，立即冰浴10 min，再加入400 μL 2×结合缓冲液稀释成（10 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，2.7 mM KCl，0.2 mM EDTA-2Na，1 mg/mL BSA，0.05% Tween-20，1% 葡萄糖，15 mM MgCl₂）。
EP管中将800μL初始ssDNA文库和洗涤后的靶标细菌混合，28 ℃，220 r /min孵育1h后，4 000 r离心6 min弃上清。用tbe缓冲液基础缓冲吹打重悬复合物，4 000 r离心5 min，弃上清，重复洗涤重3次，最后用200 μL ddH2O重悬。 复合物95 ℃热变性5 min，立即冰浴10 min，4℃，10 000 r /min离心5 min，解离与细菌结合的ssDNA，收集上清ssDNA。 10%丙烯酰胺尿素变性胶电泳，用等体积2×TBE-Urea Sample Bufer稀释样品，70℃水浴变性5 min，冰上冷却10min。在1×TBE电泳缓冲液中，凝胶上样前先200V预电泳20min，吹打上样孔再加5μL样品，200V电泳22 min后，将胶块放在在TBE缓冲液加入核酸染料浸泡染色10 min。
10%丙烯酰胺尿素变性胶电泳条带情况如图左：泳道1结合后富集的ssDNA；泳道2、3为初始文库，泳道4为140nt的ssDNA ladder。可见初始文库条带正常，但是结合后富集的ssdna跑不下来，条带也偏大。用初始文库和富集的ssDNA作为模板进行不同轮数和不同温度pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳结果如图右，泳道1、5为富集ssDNA为模板的扩增产物；泳道2、3、6、7：初始文库为模板的扩增产物，可见pcr条带弥散。
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