体外转录制备crRNA

发表于 2023-9-12 09:22:20

请问crRNA怎么转录得到呀，求一套方案

发表于 2023-9-12 09:22:21

zuotaoxy 发表于 2023-9-12 17:30
参考魏文胜团队的文献，有一篇新冠的，很详细

不是环状rna,是crispr rna.CRISPI-cas系统里面的

发表于 2023-9-12 17:30:33

参考魏文胜团队的文献，有一篇新冠的，很详细

发表于 2023-9-12 18:30:53

YK183483 发表于 2023-9-12 18:04
不是环状rna,是crispr rna.CRISPI-cas系统里面的

如果不长，直接送合成；如果比较长，promega、takara等公司，包括国内一些企业，都有转录kit，可以设计plasmid模板，自己照着说明书做就可以；实在不行找个专门做这个的外包公司，也就几千块

发表于 2023-9-12 20:22:10

在CRISPR-Cas系统中，crRNA（CRISPR RNA）通常是通过体外转录进行制备的。下面是一般的crRNA体外转录制备步骤：

1. crRNA设计：根据目标基因序列设计一个包含适当的启动子序列和结构修饰的DNA模板。

2. DNA模板合成：使用合成生物学技术，如化学合成或PCR扩增，制备含有设计好的DNA模板的DNA片段。

3. 准备转录反应体系：在无核酸酶的条件下准备体外转录反应，组成包括：
- DNA模板：上述合成或扩增得到的DNA模板。
- rNTPs（简化为ATP、CTP、GTP和UTP）：将加入反应体系中提供核苷酸原料。
- RNA聚合酶：选择与启动子序列匹配的RNA聚合酶。

4. 进行转录反应：将上述组份混合在一起，在适当的温度和时间下进行体外转录反应。通常，转录反应会在37摄氏度下进行，并在数小时内完成。

5. 纯化crRNA：对生成的反应混合物进行纯化以获得纯净的crRNA。可能的纯化方法包括：
- 酚/氯仿提取：使用酚/氯仿提取分离crRNA。
- 凝胶电泳：通过凝胶电泳分离crRNA。
- 柱层析：使用RNA纯化柱进行层析纯化。

6. 测定浓度和质量：使用光谱测定仪或其他方法确定crRNA的浓度和质量。

需要注意的是，具体的实验条件和试剂可能会因实验室和实验细节而有所不同。因此，在进行实验之前，建议参考相关文献和所用试剂的说明书，并根据实际情况进行优化和调整。

发表于 2023-11-20 08:23:33

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